Lahir dalam pernikahan antara Luigi Pacinotti, seorang fisikawan berbakat dan akademisi, dan Caterina Catanti, anak pertama dari sebelas bersaudara, ia belajar di Sekolah Tinggi Ilmiah Nusantara "Santa Caterina" pada 1859 ambil bagian dalam Perang Kemerdekaan Italia II sebagai sersan sukarela di Goito dan Pertempuran Solferino dan San Martino.
Antonio Pacinotti menempuh pendidikannya di sekolah Pisa dan mendapat hasil yang sangat cemerlang, pada usia 15 tahun dia diterima untuk mengikuti kursus matematika dan terapan di Universitas. Dia adalah murid Carlo Matteucci dan lulus dalam matematika di Pisa dengan Riccardo Felici.
Pada 1862 ia mendapat bantuan sah dari astronom Giovanni Battista Donati dan pada periode ini ia juga menemukan sebuah komet (dikenal sebagai 1862 III),[1] kemudian ia menjadi profesor di Institut Teknik Bologna dari 1864, profesor fisika di Universitas Cagliari pada 1873 dan, akhirnya, ia menggantikan ayahandanya pada 1881 di Fisika Teknologi Universitas Pisa. Di antara murid-muridnya ada Augusto Righi yang akan menjadi penerusnya.
Selama tinggal di Cagliari ia bertemu dan menikah pada 29 April1882 dengan Maria Grazia Sequi Salazar yang berusia sembilan belas tahun, yang meninggal sebelum waktunya di Pisa pada 25 Februari tahun berikutnya bersama dengan putra pertamanya. Dia menikah lagi dengan Angelini Lina dari siapa putrinya Maria Antonia lahir.[2]