El 1565 s'establí el matrimoni entre Bàrbara i el ducAlfons II d'Este, que se celebrà el 5 de desembre d'aquell any a Ferrara. Tot i que el matrimoni fou feliç no tingueren fills
Entre 1570 i 1571, després que un terratrèmol arrasés part de la ciutat de Ferrara, dedicà part de la seva fortuna en la fundació del Conservatore delle orfane di Santa Bárbara. Tot i les seves fortes conviccions catòliques establí una gran relació amb la seva sogra Renata de França, de religió protestant.