Landevejscyklingens enkeltstart for damer under Sommer-OL 2020 fandt sted onsdag den 28. juli2021.
Ruten var 22,1 km lang og startede og sluttede på Fuji International Speedway stadion. De første 2,7 km blev kørt på Fuji Speedway, hvorefter der blev kørt ud på en rundstrækning, der indeholdte en enkelt mindre stigning på 5,4 km og en stigning på 221 meter. Efter stigningen var der nedkørsel i 5,2 km indtil indkørslen til Fuji Speedway, hvor de sidste 6,6 km blev tilbagelagt.