Mascherano startede sin karriere i River Plate, hvor han vandt sin første seniorhæder, den argentinske Primera División, i 2003-04. Han flyttede til brasilianske Corinthians i 2005 og vandt den brasilianske Série A i sin første sæson. Mascherano flyttede derefter til Europa og skrev kontrakt med Premier League-klubben West Ham United, men hans korte tid i klubben blev hæmmet af usædvanlige kontraktvilkår med Global Soccer Agencies. I begyndelsen af 2007 skiftede han til Liverpool på lån, hvor han nåede finalen i UEFA Champions League, før han skrev under med klubben for £18,7 millioner. Efter tre år i Liverpool skiftede Mascherano til Barcelona i 2010, hvor han ændrede sin position fra defensiv midtbanespiller til fuld central forsvarsspiller. Med Barcelona vandt han fem La Liga-mesterskaber, to UEFA Champions League-titler og to FIFA Club World Cups, blandt andre hæder.
Mascherano spillede 147 kampe for det argentinske landshold og er den næstmest spillede spiller i landets historie (efter Lionel Messi). Fra sin debut i 2003 indtil sin pensionering i 2018 repræsenterede han nationen ved fem Copa América-turneringer, hvor han blev nummer to i 2004, 2007, 2015 og 2016, og fire FIFA World Cups, hvor han nåede finalen i 2014. Han vandt to guldmedaljer ved Sommer-OL, i 2004 og 2008, og blev den første mandlige fodboldspiller, der opnåede denne dobbelte bedrift, siden den ungarske forsvarsspiller Dezső Novák i 1968. Mellem 2008 og 2011 var Mascherano kaptajn for Argentina.
Han spillede desuden for Argentinas fodboldlandshold i perioden 2003-2018. Pr. juni 2018 havde han spillet 147 landskampe[2] og scoret tre mål. Efter nederlaget til Frankrig i ottendedelsfinalen ved VM i Rusland 2018 offentliggjorde Mascherano, at han stoppede på landsholdet.[3]
