Roux ging in Aurillac und Puy zur Schule. Er studierte in Clermont-Ferrand zunächst Naturwissenschaften (Abschluss mit Licence 1871) und dann von 1872 bis 1873 Medizin, 1874 bis 1878 setzte er sein Studium am Hôtel-Dieu in Paris bei Émile Duclaux fort.
Roux wurde 1878 Préparateur, das heißt Übungsleiter, am Labor für physiologische Chemie der École pratique des hautes études (EPHE) unter Louis Pasteur. Zusammen mit diesem führte Émile Roux als Assistent wichtige Untersuchungen zum Auslöser von Infektionskrankheiten sowie den Prinzipien der Impfung durch. Am 1888 eröffneten Institut Pasteur gab Roux mikrobiologischen Unterricht und leitete den Service de Microbie Technique. Als Nachfolger von Émile Duclaux wurde er 1904 Generaldirektor des Instituts Pasteur, das er bis zu seinem Tod 1933 leitete. Zugleich war er Direktor des Labors für physiologische Chemie in der II. Sektion (Physik und Chemie) bzw. ab 1926 der III. Sektion (Naturwissenschaften und Physiologie) der EPHE.
Barbara I. Tshisuaka: Roux, Pierre Paul Émile. In: Werner E. Gerabek, Bernhard D. Haage, Gundolf Keil, Wolfgang Wegner (Hrsg.): Enzyklopädie Medizingeschichte. De Gruyter, Berlin / New York 2005, ISBN 3-11-015714-4, S. 1271.
Paul de Kruif: Roux und Behring. Gegen die Diphtherie! In: Paul de Kruif: Mikrobenjäger. (Originalausgabe: Microbe Hunters. Harcourt, Brace & Co., New York 1926) Orell Füssli Verlag, Zürich/Leipzig 1927; 8. Auflage ebenda 1940, S. 175–197.