Don Barclay gab sein Filmdebüt im Jahr 1915 in einer Reihe von Slapstick-Stummfilm-Komödien, vor allem der „Ambrose“-Reihe mit Mack Swain. In einem dieser Filme, Ambrose’s Nasty Temper (1915), trat er auch als Keystone Kop auf. Danach konzentrierte er sich jedoch auf eine Bühnenkarriere und wirkte am Broadway in den Ziegfeld Follies von 1916 und 1917 mit. Auch während der 1920er-Jahre spielte er vornehmlich am Broadway und war in Musical-Komödien und Revuen wie Go-Go (1923), The Greenwich Village Follies (1924/25), Merry-Go-Round (1927), Nina Rosa (1930/31) oder Americana (1932) zu sehen.[2]
Beginnend mit Cinderella (Cinderella, 1950) lieh er während der 1950er- und 60er-Jahre einer Reihe von Zeichentrick-Charakteren in Produktionen Walt Disneys seine Stimme. In Disneys Mary Poppins (Mary Poppins, 1964), seinem letzten Film, spielte er schließlich seine heute bekannteste Rolle: die des „Mr. Binnacle“, dem Assistenten von „Admiral Boom“.