Fue fundada por Federico Borromeo en el año 1618 en la Biblioteca Ambrosiana, instituida ya en el 1609. La institución nació para asegurar una formación cultural gratuita a cualquiera que tuviera cualidades artística o intelectuales. A la Pinacoteca se le unió una academia de pintura y escultura, con copias en yeso del Laocoonte y de la Piedad de Miguel Ángel provenientes de la colección de Leone Leoni. El primer maestro de pintura fue el Cerano; único alumno de cierta importancia fue Daniele Crespi.
La Biblioteca Ambrosiana y la Pinacoteca están estrechamente relacionadas. De hecho, la primera ha guardado una serie de pinturas con sabios de la Antigüedad clásica y de la cultura cristiana y contenía en su interior dibujos y códices miniados: en 1637 fueron donados por Galeazzo Arconati los manuscritos de Leonardo hoy en el Instituto de Francia (hoy, después de los saqueos de Napoleón quedan sólo en el lugar el llamado Códice Atlántico). Otro tesoro de la Biblioteca es el manuscrito con la obra de Virgilio que perteneció a Petrarca (que lo glosó) con una miniatura de Simone Martini.
Interesante desde el punto de vista histórico es la producción de copias de cuadros célebres, promovida por Federico Borromeo con finalidad didáctica y documental, como la réplica de la Última Cena de Leonardo, que ya en el siglo XVII estaba en condiciones precarias.
Uno de los más preciosos tesoros que se conserva es el cartón del famoso mural La Escuela de Atenas de Rafael. Mide casi ocho metros de largo y es, de hecho, el cartón más grande que subsiste del Renacimiento italiano.
El diseño actual de la galería viene de unas recientes renovaciones hechas desde 1990 hasta 1997. Debido a los bombardeos de 1943 existen ya sean consecutivas ampliaciones o reparaciones que son la renovación de 1905 a 1906 bajo la dirección de Luca Beltrami, Antonio Luigi Grandi y Cavenaghi, la de 1938 por Ambrogio Annoni y finalmente una en 1963 confiada a Luigi Caccia Dominoni.
