Après quelques petits rôles au cinéma en 2001 — la potache mais remarquée comédie Dodgeball, puis les drames Wonder Boys, de Curtis Hanson et Chevalier, de Brian Helgeland —, il est révélé l'année suivante en faisant partie de la distribution d'acteurs quasi inconnus rassemblés par Joss Whedon pour sa nouvelle série, Firefly. Le comédien se voit confier le rôle du pilote du vaisseau Serenity, l'iconoclaste et astucieux Hoban « Wash » Washburne. Le programme est acclamé par la critique, mais sa diffusion est arrêtée par la chaîne FOX au bout de 11 épisodes sur les 14 produits, faute d'audiences.
Parallèlement, l'acteur se fait remarquer dans le secteur de la capture de mouvement, en prêtant ses traits et sa voix au robot Sonny dans le blockbuster de science-fiction I, Robot, d'Alex Proyas, sorti en 2004. L'année suivante, il retrouve la bande de Firefly pour le film Serenity, concluant la série télévisée, sous la direction du créateur Joss Whedon. L'année suivante, il revient à la télévision le temps d'un épisode remarqué de CSI, dans lequel il joue un criminel redoutable et inquiétant.
En 2007, l'acteur fait partie du casting de la comédie Joyeuses Funérailles, de Frank Oz ; et de l'équipée sauvage du western 3h10 pour Yuma, de James Mangold. L'ensemble de la distribution masculine voit son travail récompensé. Parallèlement, Joss Whedon lui confie un rôle récurrent de sa nouvelle série, Dollhouse. L'acteur y incarne un tueur psychopathe, Alpha, l'antagoniste de l'héroine durant une première saison diffusée début 2009 par la chaine FOX. Il ne revient qu'en tant que guest dans la saison 2. Entre-temps, il joue dans trois épisodes de la série de science-fiction, V, à l'occasion de laquelle il retrouve son ancienne partenaire de Firefly, Morena Baccarin. Mais surtout, il est recruté pour intégrer la distribution principale d'une nouvelle comédie loufoque de la chaîne ABC, Suburgatory. Durant trois saisons diffusées entre 2011 et 2014, il va jouer le dentiste Noah Warner.
Seconds rôles au cinéma et confirmation dans les voix
La même année, il confirme dans l'animation, en feignant un accent français pour le personnage de Simone, dans la comédie d'aventures jeunesse Alvin et les Chipmunks 3, puis en 2012 en faisant partie de la distribution vocale du confidentiel et indépendant Strange Frame. Mais surtout, il prête sa voix à King Candy dans le blockbuster d'animation des studios Disney Les Mondes de Ralph. Sa performance lui vaut le Annie Award pour Voice Acting. Le studio lui confie alors la voix du duc de Weselton dans leur prochaine production familiale, prévue pour l'hiver 2013, La Reine des neiges. Un succès commercial planétaire. Disney lui confie ainsi le rôle d'Alistair Krei dans son film d'animation suivant, Les Nouveaux Héros.
Parallèlement, l'acteur continue à évoluer dans des productions plus classiques : d'abord en incarnant un candidat démocrate dans le film fantastique Abraham Lincoln, chasseur de vampires, de Timur Bekmambetov, puis en retrouvant le scénariste/réalisateur Brian Helgeland pour le biopic sportif 42. Il y joue Ben Chapman, ex-joueur de baseball devenu le manager des Phillies de Philadelphie qui s'opposa à la présence de Jackie Robinson dans une équipe de ligue majeure en raison de sa couleur de peau.
En 2014, il joue dans les films indépendants Welcome to Me et Tell, puis en 2015, il prête ses traits à une autre figure réelle, Ian McLellan Hunter, pour le biopic Dalton Trumbo. Il reste également fidèle à la science-fiction en incarnant Markus dans le blockbuster de science-fiction pour ados Le Labyrinthe : La Terre brûlée, de Wes Ball.
Diversification
En , il lance Con-Man, sa propre web-série en tant que scénariste-réalisateur et principal interprète, sur la plateforme collaborative Viméo. Basée sur son expérience des conventions de fans de science-fiction, le programme est une satire d'un écosystème à part du monde hollywoodien. Tudyk y invite de nombreux anciens collaborateurs, et notamment les acteurs de Firefly. En tête, son ami, l'ex-Malcolm Reynolds Nathan Fillion, jouant plus ou moins son propre rôle : celui d'un acteur reconverti en tête d'affiche d'une série très populaire. Ce projet indépendant, remarqué, passe sur la plateforme Comic-Con HQ pour sa seconde saison diffusée fin 2016.
Parallèlement, l'acteur tourne les premiers épisodes d'une nouvelle série de super-héros, Powerless. Il a également été annoncé au casting de la saison 2 de la série Dirk Gently, détective holistique[1].