Créée en 1985 par le regroupement de 29 entreprises indépendantes, dont la société française Veolia Transport en assurait l'organisation en Belgique, en France, aux Pays-Bas et au Portugal[3] avant la fusion avec le groupe Transdev en 2011[4].
Le , Transdev annonce être entré en négociations exclusives avec Flixbus afin de lui céder l'entreprise Eurolines[7].
Le , Eurolines-Isilines est racheté officiellement par FlixBus. Ce rachat porte sur les activités d'Eurolines en France, aux Pays-Bas, en Belgique, en République Tchèque et en Espagne[8]. Avec ce rachat, cela réduit à deux opérateurs le marché français des transports par car de passager en longue distance : l’allemand FlixBus, et le français Ouibus (devenu en 2019 BlaBlaBus)[9][source insuffisante].
En juin 2020, Flixbus ambitionne de demander la liquidation judiciaire d'Eurolines[10]. Une telle décision entraînerait le licenciement de plus d'une centaine de salariés qui subissent la stratégie de Flixbus de démanteler un concurrent pour se laisser le champ libre sur le marché[11]. Sur les 115 salariés que compte Eurolines, 70 font déjà l'objet d'un PSE. Les 45 autres vont donc devoir quitter l'entreprise avec le minimum légal d'indemnités une fois sa liquidation prononcée[12].
La liquidation judiciaire est prononcée le 26 juin 2020[13].
Eurolines cesse l'ensemble de ses activités le 24 juillet 2020[14].
En 2015, d'autres gares routières sont ajoutées au réseau, comme la gare routière de Toulouse, mais c'est surtout Isilines, autre filiale de Transdev, qui opère la majorité des liaisons interrégionales.