Gene Wilder est le fils d'un couple de juifs russes ayant émigré aux États-Unis. Il étudie l'art dramatique à l'université de l'Iowa, dont il sort diplômé en 1955. Après un passage par l'armée de 1956 à 1958 et par l'Angleterre où il fréquente la Old Vic Theatre School de Bristol, il revient aux États-Unis où il donne des cours d'escrime et conduit des limousines afin de continuer le théâtre. Sa carrière décolle en 1961 lorsqu'il joue à Broadway dans des pièces comme The Complaisant Lover ou Roots. Trois ans plus tard, il est remarqué par Mel Brooks alors qu'il joue aux côtés d'Anne Bancroft, la compagne du réalisateur, dans Mother Courage and her Children.
Après le décès de sa troisième épouse, l'actrice Gilda Radner, des suites d'un cancer, il prend part activement à la recherche contre cette maladie. Il est lui-même atteint en 1999 de la maladie d'Hodgkin ; un an plus tard, il est parfaitement rétabli. Après un bref passage à la télévision dans la série Will et Grace en 2002-2003, il publie ses mémoires, Kiss Me Like a Stranger.
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