Вторичная структура последовательности свинцового рибозима, полученная с помощью MFold. Стрелка указывает на место расщепления.
Свинцовый рибозим (англ.leadzyme) — небольшой искусственно созданный рибозим. Свинцовый рибозим осуществляет расщепление РНК в присутствии свинца[1]. Он способен катализировать расщепление специфической фосфодиэстерной связи .Это было обнаружено в ходе исследования эволюции в искусственных условиях (in vitro), в ходе которого исследователи отбирали РНК, которые расщеплялись в присутствии свинца.[2][3] Было обнаружено несколько естественных образцов, хотя впервые он был создан в лаборатории.[4]
Было обнаружено, что свинцовый фермент эффективен и динамичен[5] в присутствии микромолярных концентраций ионов свинца.[6] В отличие от других небольших саморасщепляющихся рибозимов, ионы других двухвалентных металлов не могут заменить Pb2+ в свинцовом рибозиме. В связи с обязательной потребностью в свинце рибозим называют металлорибозимом.
Свинцовый рибозим подвергся обширному биохимическому и структурному
Визуализация основной и прекаталитической конформаций свинцового фермента. Зеленые сферы представляют ионы Mg2+, а красные сферы представляют ионы Sr2+. Рисунок визуализирован в Pymol с использованием координат из файла PDB 1NUV.
исследованию.[7] Его минимальная вторичная структура на удивление очень проста: он состоит из асимметричной внутренней петли, состоящей из шести нуклеотидов. и спиральной области на каждой стороне внутренней петли.
Место расщепления свинцового рибозима расположено внутри асимметричной внутренней петли длиной четыре нуклеотида, которая состоит из спиралей РНК с обеих сторон. Структура свинцового рибозима в 2003 году была определена методом рентгеновской кристаллографии с разрешением 1.8 ангстрема[8], а так же с помощью программного обеспечения MFold и ЯМР.[9][10]
Каталитический механизм
Считается, что свинцовый рибозим осуществляет катализ с использованием двухэтапного механизма:
На первой стадии реакции фосфодиэстерная связь расщепляется на два продукта: 5’-продукт, оканчивающийся 2’3’-циклическим фосфатом, и 3’-продукт, оканчивающийся 5’-гидроксилом. Этот этап напоминает другие небольшие саморасщепляющиеся рибозимы, такие как рибозим типа Hammerhead и рибозим вирусного гепатита D. Оба этих рибозима образуют продукт, содержащий 2’,3’-циклический фосфат. Однако в случае свинцового рибозима этот продукт является лишь промежуточным продуктом.
На втором этапе этой реакции 2’3’-циклический фосфат подвергается гидролизу с образованием 3’монофосфата. Этот вид катализа больше похож на то, как функционируют рибонуклеазы (белки), чем на любой другой известный небольшой саморасщепляющийся рибозим.
Считается, что свинцовый рибозим имеет очень динамичную структуру.[11][12] Многие исследования, включая ЯМР, рентгеновскую кристаллографию и молекулярное моделирование, выявили несколько разные структуры. С помощью спектроскопии с временным разрешением было показано, что активный центр свинцового рибозима очень динамичен.[13] Он отбирает множество различных конформаций в растворе. Дельта G взаимного превращения между различными конформациями очень мала. В соответствии с этими исследованиями кристаллическая структура с высоким разрешением также показала две различные конформации свинцового рибозима с разными местами связывания для Mg2+ и Sr2+ (заменители Pb2+) в двух конформациях.[9] В основном состоянии свинцовый рибозим связывает один ион Sr2+ у нуклеотидов G43, G45 и A45. Этот место связывания находится вдали от места расщепления и, таким образом, не объясняет участие Pb2+ в катализе. Однако во второй конформации, называемой «прекаталитическим» состоянием, можно заметить два местасвязывания Sr2+. G43 и G42 взаимодействуют с одним Sr2+, тогда как второй Sr2+ взаимодействует с A45, C23 и G24. Это второе место связывания Sr2+ также потенциально взаимодействует с 2’-OH C23 через молекулу воды и объясняет, как Pb2+ может способствовать катализу, отрывая протон 2-OH и подготавливая его к поточной нуклеофильной атаке на разрезаемый фосфат. Это также подтверждается тем фактом, что реакция свинцового фермента зависит от pH. Таким образом, Pb2+ может действовать как кислота Льюиса и активировать 2-OH в C23. Кристаллическая структура соответствует двухметаллическому ионному механизму, который был предложен для катализа свинцовым рибозимом.[14]
Токсичность свинца
Показано, что последовательность нуклеотидов, гомологичная свинцовым рибозимам, присутствует в 5S рРНК, высказаны предположения о том, что свинцовые рибозимы могут принимать участие в токсическом действии свинца[15].
Токсичные металлы, такие как свинец, представляют опасность для окружающей среды и здоровья и при воздействии могут проникать в биологические системы. Свинец является стойким металлом и может со временем накапливаться в организме человека из-за его частого использования в промышленности и присутствия в окружающей среде. Вдыхание свинца может иметь последствия, варьирующиеся от едва заметных симптомов до серьезных заболеваний. Вполне возможно, что присутствие свинца в наших биологических системах может вызвать катализ ионами свинца.[16] Поскольку свинцовый рибозим представляет собой относительно простой структурный мотив, т. е. он имеет простую складку, оказывается, что в геномах многих природных систем существует множество последовательностей, которые потенциально могут сворачиваться в структуру свинцового рибозима. Поиск этого мотива РНК в геномах человека, дрозофилы фруктовой, Caenorhabditis elegans и Резуховидки Тали показал, что в среднем этот мотив присутствует с частотой 2-9 мотивов на 1 Мб последовательности ДНК.[16] Они также показали, что мотив свинцового рибозима очень часто встречается в последовательностях мРНК этих организмов. Таким образом, эти последовательности потенциально могут саморасщепляться в присутствии ионов свинца. Нацеливание свинца на эти мотивы РНК в мРНК и других РНК может объяснить опосредованную свинцом токсичность, приводящую к гибели клеток.[16]
Примечания
↑Pan T., Uhlenbeck O. C. In vitro selection of RNAs that undergo autolytic cleavage with Pb2+ (англ.) // Biochemistry : journal. — 1992. — Vol. 31, no. 16. — P. 3887—3895. — PMID1373649.
↑Pan T. Uhlenbeck. A small metalloribozyme with a two-step mechanism (англ.) // Nature. — 1992. — P. 560–563.
↑Pan T. Uhlenbeck. In vitro selection of RNAs that undergo autolytic cleavage with lead(2+) (англ.) // Biochemistry. — 1992. — P. 3887–3895.
↑Никитин А. В. Общая логика. Этапы развития жизни на Земле. Часть 2 (рус.). — С. 16. — 30 с.
↑Kadakkuzha B. M.; Zhao L.; Xia T. Conformational Distribution and Ultrafast Base Dynamics of Leadzyme (англ.) // Biochemistry. — 2009. — P. 3807–3809.
↑Pan, T.; Uhlenbeck, O. C. A small metalloribozyme with a two-step mechanism (англ.) // Nature. — 1992. — P. 560–563.
↑Sigel, Astrid; Operschall, Bert P.; Sigel, Helmut. Chapter 11. Complex Formation of Lead(II) with Nucleotides and Their Constituents (англ.). — de Gruyter, 2017. — P. 319–402.
↑Wedekind J. E., McKay DB. Crystal structure of the leadzyme at 1.8 A resolution: metal ion binding and the implications for catalytic mechanism and allo site ion regulation (англ.) // Biochemistry : journal. — 2003. — Vol. 42, no. 32. — P. 9554—9563. — PMID12911297.
↑ 12Wedekind, J. E.; McKay, D. B. Crystal Structure of the Leadzyme at 1.8 Å Resolution: Metal Ion Binding and the Implications for Catalytic Mechanism and Allo Site Ion Regulation† (англ.) // Biochemistry. — 2003. — P. 9554–9563.
↑Wedekind, J. E.; McKay, D. B. Crystal structure of a lead-dependent ribozyme revealing metal binding sites relevant to catalysis (англ.) // Nature Structural Biology. — 1999. — P. 261–268.
↑Hoogstraten, C. G.; Legault, P.; Pardi, A. NMR solution structure of the lead-dependent ribozyme: evidence for dynamics in RNA catalysis" (англ.) // Journal of Molecular Biology. — 1998. — P. 337–350.
↑Kadakkuzha, B. M.; Zhao, L.; Xia, T. Conformational Distribution and Ultrafast Base Dynamics of Leadzyme // Biochemistry. — 2009. — С. 3807–3809.
↑Kadakkuzha, B. M.; Zhao, L.; Xia, T. Conformational Distribution and Ultrafast Base Dynamics of Leadzyme (англ.) // Biochemistry. — 2009. — P. 3807–3809.
↑Ohmichi, T.; Sugimoto, N. Role of Nd3+ and Pb2+ on the RNA Cleavage Reaction by a Small Ribozyme† (англ.) // Biochemistry. — 1997. — P. 3514–3521.
↑Barciszewska M. Z., Wyszko E., Bald R., Erdmann V. A., Barciszewski J. 5S rRNA is a leadzyme. A molecular basis for lead toxicity (англ.) // J. Biochemistry : journal. — 2003. — Vol. 133, no. 3. — P. 309—315. — PMID12761166.
↑ 123Barciszewska, M. Z. Lead toxicity through the leadzyme (англ.) // Mutation Research/Reviews in Mutation Research.. — 2005. — P. 103–110.