Первый полёт совершил в 1941 году. Изначально разрабатывался для транспортировки тяжёлой техники массой до 20 тонн при высадке на Британские острова. После создания планёра была обнаружена проблема с отсутствием подходящего буксировщика, для разрешения которой был создан Heinkel He. 111Z.
В 1942 году Me. 321 привлекались для перевозки грузов между Ригой и Оршей, а также для снабжения частей вермахта, окружённых под Демянском. В начале 1943 года в ходе битвы за Кавказ Me. 321 c крымских аэродромов доставляли грузы войскам вермахта на Кубани, обратными рейсами вывозя раненых.