Tehetségére korán fény derült, és az 1994/1995-ös idényben (mindössze 17 évesen) már a profik között játszott a 2. ligás Cesena csapatában. Ebben a szezonban egyből alapembere is lett a gárdának, és mivel a bajnokság végén a 8. helyen zártak, teljesítményére felfigyeltek a nagyok is.
A fiatal tehetségért folytatott versenyt végül a Milan nyerte meg.
A Cagliari ellen debütált a Serie A-ban. Abban a szezonban 7 meccsen lépett pályára, de ez nem meglepő, hiszen olyan vetélytársai voltak a középpályán, mint Albertini, Donadoni, Desailly, Lentini, Eranio, Roby Baggio, vagy éppen Boban.
Következő szezonjában ugyan többet lépett pályára, de rendszerint csak pár perc lehetőséget kapott a bizonyításra, ezért kölcsönadták a szintén Serie A-s Vicenzának erősödni.
Itt Zauro és Baronio mellett olyan jól játszotta végig a szezont a még mindig csak 20 esztendős fiatalember, hogy a piros-feketék visszahívták Milánóba, ahol később bajnoki címet is ünnepelhetett.
Az 1999/2000-es idényben továbbra is stabil kezdőjátékos maradt. Az elkövetkező két évben térd problémái miatt mindössze 25 mérkőzésen szerepelt, igaz, 2002 első felében a 9 meccsen 3 gólt szerzett.
2003-ban egy Bajnokok Ligája elsőséggel, és egy kupagyőzelemmel tért vissza, de már korántsem volt olyan biztos helye a kezdőcsapatban. 2004-ben újabb olasz bajnoki címmel gyarapodott éremgyűjteménye, amelyből a Lazio elleni meccset az ő találata döntötte el. Bár nyáron hívta a Real Madrid, Ambrosini Milánóban maradt. Ez azért volt meglepő, mert Gattuso mellett Massimora csak csereként számított Ancelotti mester.
A 2005-ben a Bajnokok Ligája elődöntőjében, a PSV elleni visszavágó utolsó percében szerzett fejesgóljával jutott tovább a milánói gárda.
