Figlio di un medico, Eugène Nicolle, attivo presso l'ospedale di Rouen, apprende da lui le prime nozioni di medicina. Trasferitosi a Parigi studia presso l'Istituto Pasteur, per poi rientrare nel 1896 a Rouen per dirigere il laboratorio batteriologico dell'ospedale locale.
Nel 1903 verrà nominato direttore dell'Istituto Pasteur, dove insegnerà fino a poco tempo prima della morte, avvenuta nel 1936, durante un viaggio di studio in Tunisia.